Nachweis des Cytomegalievirus (CMV) mittels digitaler PCR in Stuhlproben für die nicht

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Dec 09, 2023

Nachweis des Cytomegalievirus (CMV) mittels digitaler PCR in Stuhlproben für die nicht

Virologie-Journal

Virology Journal Band 19, Artikelnummer: 183 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

CMV-Gastroenteritis tritt häufig bei Patienten auf, die eine allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation erhalten, und ist schwer von der akuten Graft-versus-Host-Krankheit (aGvHD) zu unterscheiden, die sehr ähnliche Symptome aufweist, aber eine ganz andere Behandlung erfordert. CMV-Gastroenteritis wird durch eine lokale Infektion oder Reaktivierung von CMV im Magen-Darm-Trakt verursacht, während aGvHD auf eine Immunabstoßung zurückzuführen ist. Der Goldstandard für die Diagnose von CMV-Gastroenteritis und aGvHD ist die gastrointestinale Biopsie unter Endoskopie, die invasiv ist und möglicherweise zu schwerwiegenden Nebenwirkungen führen kann. Die Untersuchung von Stuhlproben mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) kann eine Alternative sein, während die Anwendung bei Spurenmessungen und die Präzision in der berichteten Forschung nicht alle zufriedenstellend genug sind.

In dieser Studie haben wir eine neuartige Methode entwickelt, die die zellfreie DNA (cfDNA) aus dem Stuhlüberstand extrahiert, um eine digitale PCR (dPCR) zum Nachweis von CMV durchzuführen, die Leistung zu analysieren und sie mit der mit dem aktuellen Verfahren extrahierten Gesamt-DNA zu vergleichen .

Zweiundzwanzig gepaarte Stuhlproben mit zwei DNA-Extraktionsmethoden bewiesen, dass die cfDNA-Extraktionsmethode deutlich höhere DNA-Konzentrationen und eine höhere Kontrollgenkopienzahl aufwies, was darauf hindeutet, dass cfDNA möglicherweise informativer und nützlicher für den Nachweis von CMV-DNA-Segmenten ist. Der dPCR-Ansatz zum Nachweis von CMV-DNA-Segmenten weist außerdem eine gute Linearität (R2 = 0,997) und eine höhere Empfindlichkeit auf (Nachweisgrenze bei 50 % betrug 3,534 Kopien/μl). Es wurden 82 Stuhlproben von 44 immungeschwächten Patienten analysiert. Die CMV-positive Rate lag bei 28 %, was darauf hinweist, dass mehr als ein Viertel der gastrointestinalen Symptome bei diesen Patienten durch eine CMV-Infektion oder -Reaktivierung verursacht werden können.

Die kombinierten Ergebnisse legen nahe, dass der Nachweis von CMV durch dPCR in der cfDNA des Stuhlüberstands eine leistungsstarke Methode zur Identifizierung von CMV-Gastroenteritis ist und bei der Entscheidungsfindung zur klinischen Behandlung hilft.

Gastrointestinale Symptome treten häufig bei immungeschwächten Patienten auf, beispielsweise bei denen, die eine allo-HSCT erhalten, und werden höchstwahrscheinlich durch CMV-Gastroenteritis [1] und/oder gastrointestinale aGvHD [2] verursacht. Der Goldstandard für die Diagnose von CMV-Gastroenteritis oder gastrointestinaler aGvHD ist die gastrointestinale Biopsie, ein invasives Verfahren, das möglicherweise zu schwerwiegenden Nebenwirkungen wie gastrointestinalen Blutungen oder Perforationen führen kann [3, 4]. Nichtinvasive Methoden wie der Nachweis von CMV-DNA-Segmenten mittels qPCR aus Stuhlproben immungeschwächter Patienten gelten als potenzieller Ersatz für die Magen-Darm-Biopsie [5]. Es besteht jedoch kein allgemein anerkannter Konsens über die diagnostische Aussagekraft des Nachweises von CMV-DNA-Segmenten in Stuhlproben für CMV-Gastroenteritis. Mehrere Studien haben gezeigt, dass PCR-basierte Stuhltests zum Nachweis von CMV-DNA-Segmenten für die Diagnose einer CMV-Gastroenteritis [6,7,8] oder zumindest für den Ausschluss [5, 9] wertvoll waren. Andere Studien deuten darauf hin, dass der CMV-Nachweis im Stuhl ein uneingeschränkter Prädiktor für eine CMV-Enteritis ist [10, 11]. Bemerkenswert ist, dass das DNA-Extraktionsverfahren einen entscheidenden Einfluss auf den CMV-Nachweis in Stuhlproben haben kann. Erstens handelt es sich bei Stuhlproben um eine komplexe Matrix mit unterschiedlichen Komponenten, die bei der DNA-Extraktion und der PCR-Reaktion eine Rolle spielen können [12]. Zweitens bestimmt das DNA-Extraktionsverfahren, ob der Haupt-DNA-Typ des Produkts Gesamt-DNA oder cfDNA ist, was im Hinblick auf die Unterschiede bei der Erkennung von CMV-DNA-Segmenten nicht vollständig berücksichtigt wurde.

Im Gegensatz zur genomischen DNA (gDNA) ist cfDNA in allen Körperflüssigkeiten wie Serum, Urin und Stuhlüberstand weit verbreitet. In den letzten Jahren wurden viele beeindruckende Fortschritte in der cfDNA-Forschung erzielt, insbesondere im Bereich der nichtinvasiven Krebsfrühdiagnose und des pränatalen Screenings [13]. Die Sequenzierung von cfDNA wurde auch zur Überwachung von Infektionen und/oder Abstoßungen nach einer Lungentransplantation eingesetzt und stimmte gut mit den klinischen Ergebnissen überein [14]. Der Nachweis von CMV-DNA-Segmenten in aus Stuhlproben extrahierter cfDNA zur Diagnose einer intestinalen CMV-Infektion/-Reaktivierung wurde bisher jedoch nicht ausreichend untersucht.

Die quantitative PCR, die als Goldstandardtechnik zur Messung des DNA-Spiegels gilt, hat einige Nachteile, wie z. B. die Abhängigkeit von der Standardkurve und die Möglichkeit zur Spurenmessung, insbesondere in Gebieten, in denen es keine Standards und Spurenmessungen bei minimaler Resterkrankung und Latenz gibt Virusinfektionen. Die digitale PCR, eine neue Technologie, die seit 2011 im Handel erhältlich ist, übertrifft nachweislich die qPCR in Verdünnungstests für synthetische DNA [15]. Darüber hinaus wurde berichtet, dass der dPCR-Ansatz bei Stuhlproben, die zu Hemmungen neigen, eine bessere Leistung erbringt als ein qPCR-Assay beim CMV-Nachweis [16].

Hier berichten wir über unsere Studie zum CMV-Nachweis basierend auf verschiedenen Extraktionsmethoden, beide aus Stuhlproben. Darüber hinaus wurde die Leistung der dPCR beim Nachweis von CMV-DNA-Segmenten bewertet. Wir zeigen, dass der Nachweis von CMV in cfDNA im Stuhl mittels dPCR sensitiv und relevant für die Diagnose einer intestinalen CMV-Infektion bei immungeschwächten Patienten war.

In diese Studie wurden von 2017 bis 2020 Patienten aufgenommen, die eine allo-HSCT- oder chimäre Antigenrezeptor-T (CAR-T)-Zelltherapie erhielten und länger als zwei Wochen lang gastrointestinale Symptome wie Bauchschmerzen und Durchfall hatten. Die Studie wurde von genehmigt die Ethikkommission des Tongji-Krankenhauses, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology (TJ-IRB20180809). Die Einverständniserklärung der Teilnehmer wurde eingeholt. Wässrige Stuhlproben wurden in sterile Behälter gegeben und sofort nach der Entnahme an das Labor geschickt, für kurze Zeit bei 4 °C gelagert und dann innerhalb von 8 Stunden nach der Entnahme verarbeitet.

Wir haben die wässrigen Stuhlproben mit einem 300-Mesh-Filtertuch gefiltert und die Proben 10 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert, den Überstand entnommen und erneut 10 Minuten lang zentrifugiert, um die greifbaren Bestandteile zu entfernen. Beide Methoden wurden mit 1 ml Stuhlüberstand begonnen. Zellfreie DNA und Gesamt-DNA wurden mit einem QIAamp Circulated Nucleic Acid Kit (Katalognummer 55114; Qiagen, Valencia, CA, USA) bzw. einem QIAamp DNA Stool Mini Kit (Katalognummer 51504; Qiagen, Valencia, CA, USA) extrahiert , gemäß den Anweisungen des Herstellers und beide Elutionsvolumina betrugen 25 µL. Die DNA-Konzentration wurde mit einem Qubit-Fluorometer 3.0 (Qubit dsDNA HS Assay Kit; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) oder einem NanoDrop-Spektrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gemessen, wenn die Konzentration außerhalb des Bereichs lag Qubit-Fluorometer (0–10 ng/µL). DNA-Proben wurden sofort in Testexperimenten verwendet oder nach der Extraktion bei –20 °C gelagert.

Sonden und Primer, die auf die konservierte Region für IE1 (angeborenes frühes Protein-Gen 1) von CMV und das Referenzgen menschliches nukleares RNase-P-Protein POP4 abzielen, wurden mit der Primer Express-Software Version 3.0.1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) entwickelt synthetisiert von der Sangon Biotech Company (Shanghai, China). Die Sequenzen der CMV-Primer waren wie folgt: vorwärts 5'-GTGATCCATGTGCTTATGACTTTGT-3', rückwärts 5'-GCCTTGGTCACGGGTGTCT-3' und Sonde 5'-FAM-ATCATGTGTTTAGGCCC-MGB-3'. Die Sequenzen der Referenzprimer waren wie folgt: vorwärts 5'-GGCGGTGGTCCTGGAGTACT-3', rückwärts 5'-AGAGGCCTTTGGCTTTCTTCTT-3' und Sonde 5'-VIC-ACCCGCCACAAGC-MGB-3'. Die Längen der CMV- und POP4-Amplifikate betrugen 64 bp bzw. 68 bp.

Der dPCR-Ansatz wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt [17]. Kurz gesagt, ein Reaktionsmix bestehend aus 10 µL 2× ddPCR Supermix (keine dUTPs; Bio-Rad, Hercules, USA), Primern (1 µL, 10 µmol/L), fluoreszierend markierten Sonden (2 µL, 2,5 µmol/L), und 2 µL DNA-Matrize (Bereich 0,6–66 ng) wurden in ein Quantalife QX200 Droplet Digital PCR-System (Bio-Rad, Hercules, USA) geladen, das Gesamtvolumen des Reaktionsgemisches betrug 20 µL. Wasser-in-Öl-Tröpfchen wurden in Kartuschen mit acht Vertiefungen mit dem Tröpfchengenerator QX200 erzeugt und auf eine Polypropylenplatte mit 96 Vertiefungen übertragen, die mit Folienpapier versiegelt wurde. Die Platte wurde dann in einen ABI-Thermocycler (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) gegeben. Die Bedingungen waren wie folgt: 95 °C für 5 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen von 95 °C für 30 Sekunden, 60 °C für 1 Minute (nicht mehr als 2,5 °C/Sekunde Anstiegsrate), mit einer Haltezeit von 10 Minuten bei 98 °C und abschließendes Halten bei 4 °C. Nach der PCR wurden die Ergebnisse mit einem QX200-Tröpfchenlesegerät ausgelesen und in der QuantaSoft-Softwareversion 1.7.4 gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert. Jede Reaktion wurde einzeln analysiert und die Schwellenwerte wurden bei Bedarf manuell angepasst und separat für die Fluoreszenzkanäle angepasst. Die endgültigen Ergebnisse der Kopienzahl in den Originalproben wurden standardmäßig als Kopien/ml für das CMV-DNA-Segment und das Referenzgen dargestellt (Zusatzdateien 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7).

Die CMV-Zielsequenz wurde mit dem Plasmidvektor pUC57 verbunden, um einen Plasmidstandard zum Testen der quantitativen Kapazität zu konstruieren, und das rekombinante Plasmid wurde in E. coli DH5α transformiert, um die Proliferation abzuschließen. Das rekombinante Plasmid wurde mit dem EndoFree Plasmid Maxi Kit (Katalognummer 12362; Qiagen, Valencia, CA, USA) extrahiert und gereinigt und mit dem NanoDrop-Spektrophotometer quantifiziert. Anschließend wurde die Kopienzahl mit bekannter Konzentration, Molekülmasse und Avogadro-Konstante berechnet. Das rekombinante Plasmid wurde durch die Restriktionsenzyme HindIII (Katalognummer R0104S; NEB, USA) und BamHI (Katalognummer R0136S; NEB, USA) linearisiert, wodurch die intakte CMV-Zielsequenz auf dem linearisierten Plasmid erhalten blieb. Fünffache Reihenverdünnungen wurden bei Konzentrationen im Bereich von etwa 10.000 Kopien/µl bis 3,2 Kopien/µl durchgeführt und einer dPCR unterzogen. Jede Standardkonzentration wurde dreimal unter den gleichen Bedingungen wiederholt, um die quantitative Linearität zu bestimmen.

3 ml mit Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) antikoagulierte Vollblutproben wurden gesammelt und dann 5 Minuten lang bei 3000 U/min zentrifugiert, um 100 µl Plasma für den CMV-DNA-Nachweis zu gewinnen. Die Plasmaproben wurden verarbeitet und die CMV-DNA wurde gemäß den Anweisungen des HCMV PCR Fluoreszenz-Qualifizierungs-Detektionskits (Daan Gene, Guangzhou, China) getestet.

Alle statistischen Analysen wurden mit der Statistiksoftware R v4.0.5 durchgeführt. Der vorzeichenbehaftete Wilcoxon-Rangtest für gepaarte Stichproben, der exakte Test nach Fisher und der Chi-Quadrat-Test nach Pearson wurden in bestimmten Situationen je nach Bedarf verwendet.

Um zu beweisen, ob die DNA-Extraktionsmethode beim Nachweis von CMV-DNA-Segmenten von Bedeutung ist, verglichen wir die DNA-Konzentrationen und die Kopienzahlen der Kontrollgene zwischen übereinstimmenden identischen Stuhlproben unter Verwendung zweier DNA-Extraktionsmethoden. cfDNA wurde mit einem QIAamp Circulated Nucleic Acid Kit extrahiert, das als Kit 1 gekennzeichnet war. Die Gesamt-DNA wurde mit einem QIAamp DNA Stool Mini Kit extrahiert, das als Kit 2 gekennzeichnet war. Es wurden 22 Stuhlproben von Patienten mit verschiedenen Erkrankungen entnommen klinische Erkrankungen und Zustände. Jede Probe wurde in zwei Teile mit gleichen Volumina getrennt und getrennt einer cfDNA- und Gesamt-DNA-Extraktion unterzogen. Überraschenderweise übertraf die Konzentration der cfDNA bei gleichem Elutionsvolumen die der gepaarten Gesamt-DNA deutlich (Abb. 1A). Anschließend ermittelten wir die Anzahl der Kontrollgenkopien sowohl in der cfDNA als auch in der Gesamt-DNA, die aus gepaarten Proben extrahiert wurde, und stellten fest, dass die Anzahl der Kontrollgenkopien in der cfDNA deutlich höher war als in den Gesamt-DNA-Extrakten (Abb. 1B). Darüber hinaus konnte das Kontrollgen in 3 von 22 Gesamt-DNA-Extrakten nicht nachgewiesen werden, nicht jedoch in cfDNA-Extrakten. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die DNA-Extraktionsmethode einen erheblichen Einfluss auf die Effizienz der DNA-Extraktion hat und dass cfDNA in speziellen Proben, wie z. B. Stuhlproben, häufiger und nützlicher für den Nachweis pathogener Mikroorganismen sein könnte als Gesamt-DNA.

Passender Vergleich zwischen cfDNA und Gesamt-DNA, die aus denselben Stuhlproben mit zwei unterschiedlichen Extraktionskits extrahiert wurden. A-Punkte stellen die Konzentrationen von cfDNA und Gesamt-DNA dar, und DNA-Proben, die aus denselben Proben extrahiert wurden, sind durch graue Linien verbunden. B-Punkte stellen die Kopienzahlen des Referenzgens in DNA-Proben dar, und die aus denselben Proben extrahierten Kopien sind durch graue Linien verbunden

Vor der Anwendung auf klinische Proben wurde ein Validierungstest mit einer Positivkontrolle mit CMV- und POP4-Segmenten und einer Negativkontrolle mit nur POP4-Segmenten durchgeführt, um die Spezifität der Primer und Sonden zum Nachweis von CMV-DNA und dem Referenzgen zu testen. Sowohl die Positiv- als auch die Negativkontrolle hatten ein POP4-Signal, während nur die Positivkontrolle ein CMV-Signal aufwies (Abb. 2). Um die weitere Leistung des dPCR-Ansatzes beim Nachweis von CMV-DNA-Segmenten zu testen, haben wir einen CMV-DNA-Segmentstandard durch fünffache serielle Verdünnung des Plasmids, das das CMV-DNA-Segment enthält, von einer Konzentration von 10.000 Kopien/μl auf 3,2 Kopien/μl etabliert. Wie erwartet lagen die gemessenen Kopienzahlen des CMV-DNA-Segments ziemlich nahe an den vorhergesagten Kopienzahlen (Abb. 3A). Das R-Quadrat der linearen Regression der gemessenen Kopienzahlen betrug 0,997. Der LOD50 (Nachweisgrenze bei 50 %) gibt die Konzentration an, bei der die Hälfte der positiven Proben nachgewiesen werden kann. Um den LOD50 des dPCR-Ansatzes zum Nachweis von CMV-DNA-Segmenten zu bestimmen, haben wir zunächst eine Standardkonzentration von 80 Kopien/μL aus 10.000 Kopien/μL durch fünffache Reihenverdünnung hergestellt. Anschließend wurden zweifache Reihenverdünnungen durchgeführt, um Konzentrationen im Bereich von 40, 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625 und 0,313 Kopien/μL.

Negativ- und Positivkontrollproben für den Nachweis von CMV-DNA-Segmenten. Die magentafarbenen Linien zeigen die eingestellte Fluoreszenzschwelle zur Unterscheidung positiver und negativer Tröpfchen an. Die grauen Tröpfchen sind Tröpfchen ohne Signale. Die grünen Tröpfchen sind Tröpfchen mit einem positiven Signal für POP4. Die blauen Tröpfchen sind Tröpfchen mit einem positiven Signal für CMV-DNA. Bei den roten Tröpfchen handelt es sich um Tröpfchen mit beiden Signalen für POP4-DNA und CMV-DNA. Eine Negativkontrolle von einem gesunden Spender. B Positive Kontrolle von einem Patientenspender, bei dem bereits eine CMV-Infektion diagnostiziert wurde

Die Leistungsschätzung des Nachweises von CMV-DNA-Segmenten mittels dPCR. Ein Vergleich der erkannten CMV-DNA-Segmentkopienzahl und der vorhergesagten. Die x-Achse zeigt die vorhergesagte Kopienzahl des CMV-DNA-Segments der Standards, die durch den Verdünnungsgrad der Rohlösung mit einer bekannten Konzentration des CMV-DNA-Segments geschätzt werden kann. Die y-Achse zeigt die genaue Anzahl der nachgewiesenen CMV-DNA-Segmentkopien der Standards. Jedes rote Dreieck stellt eine Erkennung dar und jeder Verdünnungsgrad entspricht drei roten Dreiecken. Die grüne Linie stellt die Kurve mit der besten Anpassung dar. B Die Nachweiswahrscheinlichkeit des CMV-DNA-Segments bei niedrigen Konzentrationen. Die x-Achse zeigt die Plasmid-CMV-DNA-Segmentkonzentration und die y-Achse zeigt die Nachweiswahrscheinlichkeit. Das rote Dreieck stellt die Erkennungswahrscheinlichkeit dar, die durch Division der Gesamtzahl der Experimente durch die Anzahl der positiv erkannten Experimente berechnet wird. Die grüne Linie stellt die beste nichtlineare Anpassungskurve dar

Jede Standardprobe wurde achtmal getestet und die positive Erkennungsrate berechnet. Für die positiven Raten bei verschiedenen Konzentrationen wurde eine nichtlineare Regression mit einem Fitness-R-Quadrat von 0,98 durchgeführt (Abb. 3B). Der LOD50 wurde dann mit 3,534 Kopien/μL berechnet und CMV konnte mit einer Wahrscheinlichkeit von mehr als 50 % nachgewiesen werden, wenn die CMV-DNA-Segmentkonzentration in den Proben über diesem Wert lag.

Wir haben den etablierten dPCR-Ansatz angewendet, um CMV-DNA-Segmente in Stuhlproben von immungeschwächten Patienten nachzuweisen. Insgesamt wurden 44 Patienten in unsere Studie aufgenommen, von denen 33 eine Allo-HSCT-Therapie, 9 eine CAR-T-Zelltherapie und 2 sowohl eine CAR-T-Zell- als auch eine Allo-HSCT-Therapie erhielten. Elf der Patienten nahmen an klinischen Studien zur sequentiellen CD19/22-CAR-T-Zell-Immuntherapie teil, über die kürzlich in Blood berichtet wurde [18]. Die detaillierten klinischen Merkmale der Patienten sind in Tabelle 1 aufgeführt. Von diesen Patienten wurden 82 Stuhlproben entnommen, wenn sie Bauchschmerzen und Durchfallsymptome hatten, die durch die kurzfristige Anwendung von Antidiarrhoika wie Berberin und Montmorillonit-Pulver nicht kontrolliert werden konnten . Wir analysierten die CMV-positive Rate von Stuhlproben von Patienten mit unterschiedlichen Grunderkrankungen und konnten keinen signifikanten Unterschied feststellen (Abb. 4A, p = 0,81 nach Fishers exaktem Test). Entsprechend den verschiedenen Therapiemethoden unterschied sich auch die CMV-Positivrate bei Patienten, die eine CAR-T-Zelltherapie oder eine allo-HSCT-Therapie erhielten, nicht signifikant (Abb. 4B, p = 1 nach Fishers exaktem Test). Die positive Gesamtrate betrug 28 %, was darauf hindeutet, dass mehr als ein Viertel der gastrointestinalen Symptome bei diesen immunsupprimierten Patienten durch eine CMV-Infektion oder -Reaktivierung verursacht werden könnten.

Die Anzahl der CMV-positiven und CMV-negativen Proben in verschiedenen Patienten- oder Probengruppen. A-Proben werden nach verschiedenen Krankheitstypen gruppiert. Histogramme zeigen die Zusammensetzung der positiven und negativen Probenanteile. B-Patienten werden nach der Art der Hauptbehandlung gruppiert, nämlich Allo-HSCT oder CAR-T-Zelltherapie. Histogramme zeigen den Prozentsatz positiver und negativer Proben

Fall 1 (Abb. 5A) war ein 16-jähriger männlicher Patient. Im Februar 2018 wurde bei ihm akute lymphatische Leukämie diagnostiziert und er erhielt im Dezember 2018 eine allo-HSCT. Elf Tage nach der Transfusion hämatopoetischer Stammzellen waren die transplantierten Stammzellen vollständig implantiert. Zwei Monate später litt er plötzlich unter Bauchschmerzen und Durchfall. Wir fragten uns, wie effizient die Plasmaanalyse bei der Identifizierung einer CMV-Gastroenteritis ist und wie gut sie mit dem Stuhl übereinstimmt. Aus diesem Grund wurden Plasmaanalysen durchgeführt. Das Plasma-CMV-DNA-Segment wurde unmittelbar nach Auftreten gastrointestinaler Symptome getestet und das Ergebnis war negativ. Der Nachweis von CMV-DNA-Segmenten im Stuhl aus cfDNA wurde ebenfalls zwei Tage später durchgeführt und war negativ. Die Beschwerden hielten mehr als zwei Wochen an und zur Differenzialdiagnose war eine Enteroskopie erforderlich. Die Enteroskopie-Biopsie und der Nachweis von CMV-DNA-Segmenten aus Darmgewebe bestätigten, dass es sich um aGvHD handelte. Nach einem Monat Behandlung gegen die Immunabstoßung hatte er seltener Durchfall, entwickelte aber plötzlich rektale Blutungen. Sowohl der Nachweis von CMV-DNA-Segmenten im Plasma als auch im Stuhl war positiv, was stark auf eine CMV-Gastroenteritis schließen lässt. Dementsprechend verlagerte sich der Behandlungsschwerpunkt auf die antivirale Therapie. Eine Woche nach der antiviralen Behandlung konnte in den Plasmaproben kein CMV-DNA-Segment nachgewiesen werden, in den Stuhlproben blieben jedoch weiterhin hohe Kopienzahlen erhalten. Einen Monat nach der antiviralen Behandlung war das CMV-DNA-Segment sowohl in Plasma- als auch in Stuhlproben negativ. Gleichzeitig verschwanden die Magen-Darm-Beschwerden allmählich. Das CMV-DNA-Segment wurde überwacht und war mehr als einen Monat lang negativ.

In zwei typischen Fällen verändert sich die Kopienzahl des CMV-DNA-Segments sowohl im Plasma als auch im Stuhl zusammen mit der Behandlung. A Der Fall zeigt, dass das CMV-DNA-Segment im Stuhl positiv, aber gleichzeitig im Plasma negativ sein könnte. B Der Fall zeigt, dass das CMV-DNA-Segment im Plasma positiv, aber gleichzeitig im Stuhl negativ sein könnte.

Fall 2 (Abb. 5B) war ein achtjähriges Mädchen, das zwei Monate lang an schwerer aplastischer Anämie gelitten hatte, bevor es eine allo-HSCT-Therapie erhielt. Die transplantierten Stammzellen waren elf Tage nach der Stammzellinfusion vollständig implantiert. Fast drei Monate später traten anhaltende Durchfallsymptome auf, wobei das CMV-DNA-Segment sowohl in Plasma- als auch in Stuhlproben zunächst negativ war. Die elektronische Enteroskopie zeigte diffuse Stauungen und Ödeme in der gesamten Dickdarmschleimhaut, und sowohl CMV als auch EBV waren in der Darmschleimhaut negativ. Anschließend erhielt sie mehr als drei Wochen lang eine verstärkte Immunsuppressionsbehandlung, bevor ein CMV-DNA-Segment in Plasma und Stuhl positiv nachgewiesen wurde. Die antivirale Behandlung dauerte eine Woche, da eine Woche später das CMV-DNA-Segment im Stuhl negativ wurde. Einen Monat später war das Plasma-CMV erneut positiv und blieb mehr als einen Monat lang positiv, während das CMV-DNA-Segment im Stuhl während des gesamten Zeitraums negativ war. Mit einer verstärkten Immunsuppressionsbehandlung und einer antiviralen Behandlung erholte sie sich zwei Monate später schließlich von ihrem Durchfall.

Allo-HSCT und CAR-T-Zelltherapie sind beide von historischer Bedeutung für hämatologische Malignome. Patienten, die eine allo-HSCT- oder CAR-T-Zelltherapie erhalten, leiden häufig unter Magen-Darm-Beschwerden, CMV-Infektion oder -Reaktivierung und aGvHD, was häufige schwerwiegende Komplikationen darstellt und schwer zu unterscheiden ist. Darüber hinaus werden diese Komplikationen durch sehr unterschiedliche Behandlungen behandelt, sodass eine unsichere Diagnose ernsthafte Herausforderungen für die Behandlung mit sich bringt. Der traditionelle Test ist eine gastrointestinale Biopsie unter Endoskopie, bei der es sich um einen invasiven Eingriff handelt, der möglicherweise zu schwerwiegenden Nebenwirkungen führen kann. Zur Diagnose einer CMV-Gastroenteritis und zur Unterscheidung anderer Erkrankungen des Verdauungstrakts sind alternative Proben und Nachweismethoden erforderlich.

Die Verwendung von cfDNA zur Vorhersage oder Diagnose von Infektionen scheint herkömmlichen Strategien wie kulturbasierten Methoden hinsichtlich Durchlaufzeit und Genauigkeit überlegen zu sein [14, 19, 20]. Sequenzierungsbasierte Methoden werden mittlerweile in der Klinik häufig eingesetzt und ermöglichen den Nachweis von Krankheitserregern in einem breiten Spektrum, haben jedoch den Nachteil, dass sie immer noch etwas teuer und zeitaufwändig sind. Für den Nachweis bestimmter Krankheitserreger bieten PCR-basierte Methoden Vorteile sowohl hinsichtlich der Effizienz als auch der Empfindlichkeit. Im Vergleich zu Serum und Plasma zeichnen sich Stuhlproben aufgrund ihres massiven bakteriellen Hintergrunds sowie der PCR-Unterdrückungsmaterialien aus. Daher sind PCR-basierte Methoden für solche Proben durchaus geeignet, da sie Störungen durch andere Krankheitserreger minimieren können.

In einer früheren Studie wurde berichtet, dass DNA-Extraktionskits einen deutlichen Einfluss auf die DNA-Qualität haben, insbesondere auf die Bakterienzusammensetzung im Hinblick auf Grampositivität [21]. Die Autoren führten dies auf die Effizienz der Lyse grampositiver Bakterien durch verschiedene Extraktionskits zurück. Bei der Durchsicht der Berichte zum CMV-Nachweis zur Diagnose einer CMV-Gastroenteritis fanden wir deutlich widersprüchliche Meinungen zur diagnostischen Aussagekraft des CMV-DNA-Segmentnachweises in Stuhlproben. Interessanterweise verwendeten zwei Berichte, die zu dem Schluss kamen, dass der CMV-Nachweis für die Diagnose einer CMV-Gastroenteritis nicht unbefriedigend sei, dasselbe Extraktionskit, das QIAamp DNA Stool Mini Kit. Dieses Kit isolierte hauptsächlich gDNA aus lysierten Zellen in Stuhlproben. Wenn die Darmepithelzellen jedoch nicht zu stark dissoziierten oder wenn sie vor der Stuhlverarbeitung keine intakte Zellstruktur aufrechterhalten konnten, fehlten CMV-DNA-Segmente auch bei der endgültigen DNA-Extraktion, selbst wenn sie sich tatsächlich in Zellen befanden. Basierend auf dieser Annahme verglichen wir die cfDNA- und Gesamt-DNA-Extraktion aus denselben Stuhlproben. Wir fanden heraus, dass die DNA-Konzentrationen für cfDNA viel höher waren als für die Gesamt-DNA und auch die Kopienzahlen des Kontrollgens waren für cfDNA höher als für die Gesamt-DNA. Dieses Ergebnis kann hauptsächlich durch die Tatsache erklärt werden, dass Darmepithelzellen weitgehend lysiert, apoptosiert oder aktiv sekretiert wurden und beim Auftreten einer Gastroenteritis cfDNA in den Stuhl freisetzten, ohne dass intakte Zellen abgestoßen wurden.

Ein Vergleich zwischen dPCR und qPCR für den quantitativen Nachweis von CMV wurde berichtet und zeigte, dass qPCR eine etwas höhere Empfindlichkeit als dPCR aufwies [22], was möglicherweise durch den optimierenden Umfang des dPCR-Ansatzes verfälscht wird. In einer aktuellen Veröffentlichung unseres Zentrums [17] haben wir gezeigt, dass dPCR- und qPCR-Assays gute Korrelationen sowohl für Standards als auch für klinische Proben aufwiesen, dPCR jedoch eine bessere Wiederholbarkeit und Reproduzierbarkeit aufwies. Noch wichtiger ist, dass die Nachweisgrenze des dPCR-Ansatzes niedriger war als die von qPCR, als die beiden Methoden vollständig optimiert waren. Daher haben wir ein dPCR-basiertes CMV-DNA-Segment-Nachweisverfahren entwickelt, und die Leistungsbewertung zeigte, dass es im Nachweisbereich eine recht hohe Genauigkeit aufwies. Angesichts der hohen Spezifität haben wir auch die Empfindlichkeit getestet, indem wir den LOD50 der Standards gemessen haben. Unser LOD50 betrug 3,534 Kopien/μL (3534 Kopien/ml). Die Studie von Hayden et al. ergab, dass ihre LODs nach WHO-Standards 4571 Kopien/ml betrugen [22], wir lagen ungefähr auf dem gleichen Niveau. Weitere Optimierungen, wie z. B. die Beladungsmenge der DNA-Matrize, die Konzentration von Sonde und Primern sowie die PCR-Reaktionsbedingungen, können in Zukunft durchgeführt werden.

Eine CMV-Infektion oder -Reaktivierung wurde bei Patienten, die allo-HSCT erhielten, ausführlich untersucht, es fehlen jedoch ausreichende klinische Daten bei Patienten, die eine CAR-T-Zelltherapie erhalten. Nach bestem Wissen der Autoren ist dies der erste Bericht, der die CMV-Infektions- oder Reaktivierungsrate bei Patienten vergleicht, die eine allo-HSCT- und CAR-T-Zelltherapie erhalten. Stewart [23] fasste die infektiösen Komplikationen der CAR-T-Zelltherapie zusammen und stellte fest, dass eine CMV-Reaktivierung selbst bei Patienten ohne Prophylaxe selten vorkam. Unsere Daten zeigen, dass die CMV-Infektions- oder Reaktivierungsrate bei Patienten, die eine CAR-T-Zelltherapie erhielten, und bei Patienten, die allo-HSCT erhielten, ähnlich war. Die CMV-positive Rate betrug 30,0 % (3/10) in Proben von Patienten, die eine CAR-T-Zelltherapie erhielten, bzw. 28,6 % (20/70) in Proben von Patienten, die allo-HSCT erhielten. Da die Patienten- und Probenauswahl in unserer Studie in der klinischen CAR-T-Zellstudie nicht unvoreingenommen war, sollte die tatsächliche CMV-Infektions- oder Reaktivierungsrate in der gesamten Kohorte niedriger sein. Dennoch konnten wir daraus schließen, dass durch eine CMV-Infektion oder -Reaktivierung verursachte gastrointestinale Symptome bei Patienten, die entweder eine Allo-HSCT- oder eine CAR-T-Zelltherapie erhielten, nicht selten waren. Wir haben auch den Zusammenhang zwischen der CMV-Infektions- oder Reaktivierungsrate und der Zeit seit der Behandlung mit allo-HSCT oder CAR-T-Zelltherapie untersucht. Wie erwartet zeigte die CMV-Infektions- oder Reaktivierungsrate bei Patienten mit gastrointestinalen Symptomen keinen klaren zeitlichen Trend, was durch den anhaltenden immunsupprimierten Zustand erklärt werden könnte.

Um zu klären, ob Stuhlproben durch Plasmaproben zum Nachweis einer CMV-Infektion oder -Reaktivierung ersetzt werden können, verglichen wir die Kopienzahlen des CMV-DNA-Segments in Stuhlproben mit denen in entsprechenden gleichzeitig entnommenen Plasmaproben und beschrieben zwei Sonderfälle im Detail, um dies zu veranschaulichen Problem. Wir stellten fest, dass die Nachweisergebnisse der beiden Proben nicht gut übereinstimmten, was darauf hindeutete, dass sie nicht durch einander repräsentiert werden konnten. Daher ist es notwendig, Stuhlproben anstelle von Plasma zu testen, wenn der Verdacht auf eine CMV-bedingte Magen-Darm-Erkrankung besteht, da das Plasma wahrscheinlich negativ für den Nachweis von CMV-DNA-Segmenten ist. Darüber hinaus zeigte die Überwachung der CMV-Belastung anhand von Stuhlproben unersetzliche Vorteile gegenüber der Darmbiopsie, die als Goldstandard für die Diagnose einer CMV-Enteritis gilt. Erstens handelt es sich um eine nichtinvasive Erkennungsmethode, die Patienten vor zusätzlichen Schäden und Infektionsrisiken schützt. Zweitens ist es bequem und wirtschaftlich und ermöglicht eine häufige und kontinuierliche Erkennung zur Überwachung von Zustandsänderungen. Aus den beiden Fällen haben wir herausgefunden, dass gastrointestinale Symptome möglicherweise nicht durch eine CMV-Infektion oder -Reaktivierung ausgelöst wurden, sondern von einer nachfolgenden CMV-Infektion oder -Reaktivierung begleitet sein könnten, was den Zustand immer komplizierter machte; Daher ist die Überwachung der CMV-Belastung sowohl bei der Diagnoseklärung als auch bei der medizinischen Entscheidungsfindung wichtiger.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Nachweis von CMV durch dPCR in der cfDNA des Stuhlüberstands eine leistungsstarke Methode zur Identifizierung von CMV-Gastroenteritis ist, die eine höhere Effizienz und Empfindlichkeit aufweist und bei der Entscheidungsfindung zur klinischen Behandlung hilft.

Daten und Materialien sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Cytomegalovirus

Allogene hämatopoetische Stammzelltransplantation

Akute Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit

Zellfreie DNA

Digitale PCR

Quantitative Polymerase-Kettenreaktion

Genomische DNA

Chimäre Antigenrezeptor-T-Zelle

Angeborenes frühes Protein-Gen 1

Nachweisgrenze bei 50

Galiatsatos P, Shrier I, Lamoureux E, Szilagyi A. Metaanalyse des Ergebnisses der Cytomegalovirus-Kolitis bei immunkompetenten Wirten. Dig Dis Sci. 2005;50:609–16.

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